Muerte Súbita y Secuenciación de Siguiente Generación: revisión bibliográfica

 

Sudden death and Next Generation Sequencing: a review

 

Lucio Alfonso Chirillano 1 https://orcid.org/0000-0003-3411-4746

Pablo Elías De la Sota 1 https://orcid.org/0000-0003-1610-371X

Cristian Ariel De Candia 1* https://orcid.org/0000-0002-8438-0420

 

1 Ministerio de Seguridad de la Provincia de Buenos Aires, Superintendencia de Policía Científica, Dirección Química Legal, Departamento de Genética Forense, Buenos Aires, Argentina.

 

*Correspondencia a Cristian Ariel De Candia: cristianariel.decandia@mseg.gba.gov.ar

Subvenciones: ninguna.

 

Conflictos de interés, relación o actividad incidente: no existen.

 

 

RESUMEN

Introducción: la muerte súbita se trata de un evento fatal e imprevisible. Realizada la autopsia y estudios complementarios, en ausencia de otros hallazgos que expliquen la causa de muerte, se clasifica como muerte súbita inexplicada. Siendo recomendable en estos casos realizar análisis genéticos, especialmente con metodologías de secuenciación de siguiente generación, los que permiten explicar un porcentaje importante de estos casos. Objetivo: analizar las publicaciones más relevantes sobre secuenciación de siguiente generación, aplicada a la autopsia molecular, para determinar aquellas muertes súbitas inexplicables relacionadas a cardiomiopatías y canalopatías. Metodología: se realizó la búsqueda en PubMed del Instituto Nacional de Salud usando palabras clave en inglés y español: NGS, muerte súbita, autopsia molecular y combinaciones. Además, se realizaron búsquedas en OMIN y ClinVar relacionada a las diferentes afecciones cardiacas relacionadas a muerte súbita. Los criterios de inclusión: artículos completos en español e inglés de libre acceso, con antigüedad máxima de diez años, realizados en cualquier área geográfica y que trataran sobre la temática. Resultados: para secuenciación de siguiente generación, muerte súbita se encontraron más de 22000 y 65000 publicaciones, respectivamente. En cambio, al combinar ambas palabras clave se recuperaron 74 trabajos, según los criterios de inclusión y objetivo del trabajo se revisaron 67 artículos. La aplicación de las plataformas de secuenciación en la investigación de casos de muerte súbita tomo auge en el 2014. Y en poco tiempo, demostraron su versatilidad para el análisis de una gran cantidad de genes simultáneamente, de forma rápida y a bajo costo. Conclusiones: las patologías asociadas a muerte súbita son múltiples, complejas y pueden generar fenotipos variables que dificultan el análisis genético de las mismas. Las plataformas de secuenciación de siguiente generación son sumamente útiles en los casos de muerte súbita inexplicada, además permiten la identificación de variantes genéticas en familiares para la implementación de medidas preventivas.

ABSTRACT

Introduction: Sudden death is a fatal and unpredictable event. After autopsy and complementary studies, in the absence of other findings that explain the cause of death, it is classified as sudden unexplained death. It is advisable in these cases to perform genetic analysis, especially with next generation sequencing methodologies, which can explain a significant percentage of these cases. Objective: to analyze the most relevant publications regarding NGS applied to molecular autopsy to determine sudden unexplained deaths related to cardiomyopathies and channelopathies. Methodology: A search was performed in PubMed of the National Institute of Health using keywords in English and Spanish: NGS, sudden death, molecular autopsy, and combinations. In addition, OMIN and ClinVar were searched for the different cardiac conditions related to sudden death. Inclusion criteria: complete articles in Spanish and English, open access, not older than 10 years, published in any geographic area and dealing with the subject. Results: For next-generation sequencing and sudden death, more than 22,000 and 65,000 publications were found, respectively. In contrast, combined were 74 papers, where the application of sequencing platforms in the investigation of sudden death cases started in 2014. In a short time, they demonstrated their versatility for the analysis of many genes simultaneously, quickly and at low cost. According to the inclusion criteria and objective of the work, 67 articles were reviewed. Conclusions: The pathologies associated with sudden death are multiple, complex and can generate variable phenotypes that make their genetic analysis difficult. Next-generation sequencing platforms are extremely useful in cases of unexplained sudden death, and allow the identification of genetic variants in family members for the implementation of preventive measures.

 

PALABRAS CLAVES: NGS, Muerte Súbita, Autopsia Molecular

 

KEYWORDS: NGS, Sudden Death, Molecular Autopsy

 

 

INTRODUCCIÓN

Existen diferentes definiciones en relación con la muerte súbita (MS) o Sudden Death (SD, por sus siglas en inglés)^1-4, no obstante, la más empleada la define como la muerte repentina e inesperada de un individuo aparentemente saludable dentro de 1 hora del inicio de los síntomas, si hay testigos; o dentro de las 24 horas de haber sido vista con vida y saludable la víctima². Los casos de MS ocurridos a niños menores a 1 año, se denominan síndrome de muerte súbita infantil (SIDS, Sudden Infant Death Syndrome) o lactante, ocurren generalmente durante el sueño^5-6. La MS puede ser cardíaca, no cardíaca o inexplicada. En la Figura 1, se muestra una clasificación de la MS basada solamente en aquellas de interés genético.

 

 

 

Figura 1. Tipos de Muerte Súbita y su patología subyacente de interés genético.

 

Diversas condiciones, que pueden conducir a MS tienen un importante componente genético y, muchas veces, no presentan indicios detectables que permitan un diagnóstico certero mediante el análisis forense completo. Ante la ausencia de información contundente en la autopsia, se pueden llevar a cabo estudios genéticos complementarios, que han demostrado resolver hasta el 44% de los casos sin explicación⁷.

Los estudios genéticos llevados a cabo para determinar la causa genética subyacente a un caso de MS muchas veces reciben la denominación de “autopsia molecular”⁸, aunque la denominación más correcta sería “análisis genético post mortem”, como lo indica el Colegio Americano de Genética y Genómica Médica (ACMG, American College of Medical Genetics and Genomics)⁹.

La secuenciación data de 1977, cuando Sanger y colaboradores¹⁰ describieron una metodología de secuenciación del ADN que, con el paso del tiempo, fue sufriendo modificaciones que permitieron realizar la separación y detección de los fragmentos obtenidos mediante electroforesis capilar, aumentando la sensibilidad, especificidad y rendimiento. A principios de 1990, con el desarrollo del Proyecto Genoma Humano, apareció un nuevo método de secuenciación de ADN, como alternativa al método de Sanger, denominado pirosecuenciación¹¹. En 2004, aparecieron los primeros equipos comerciales de metodologías de Secuenciación de Siguiente Generación o NGS (Next Generation Sequencing) que utilizaban como metodología la pirosecuenciación.

En la actualidad, para secuenciar se emplean métodos químicos, no basados en el método de Sanger, que permiten obtener secuencias con mayor velocidad, fiabilidad, mayor cobertura, con resultados con una tasa baja de error y mayor rendimiento. Estas técnicas, que se conocen como Secuenciación Masiva en Paralelo (MPS, Massive Parallel Sequencing), emplean dos principios diferentes: secuenciación por ligación (SBL, Sequencing-By-Ligation, por sus siglas en inglés) y secuenciación por síntesis (SBS, Sequencing-By-Synthesis, por sus siglas en inglés).  Aunque se consideran tecnologías de diferentes generaciones, muchas veces los términos NGS y MPS se utilizan como sinónimos. En el presente trabajo, utilizaremos como denominación común el término NGS.

Asimismo, para determinar las variantes genéticas que pueden ser de interés para futuros análisis genéticos se pueden realizar dos aproximaciones distintas¹². Por un lado, se puede llevar a cabo un ensayo del tipo Secuenciación del Genoma Completo (WGS, Whole Genome Sequencing), que permite estudiar las variaciones genéticas tanto de las regiones codificantes como no codificantes. La otra aproximación es mediante la Secuenciación de Exoma Completo (WES, Whole Exome Sequencing) que permite estudiar las variaciones genéticas solo de las regiones codificantes, siendo esta especialmente prometedora para el estudio de patologías hereditarias raras. Aunque el costo por base es el mismo, la cantidad de bases a secuenciar es mucho menor en la WES que en la WGS, por lo que su costo total es menor.

Una vez definido el panel de genes a analizar (mediante WGS o WES), se puede realizar una secuenciación dirigida por NGS, a fin de acotar el análisis solo a los genes de interés¹². Esta secuenciación dirigida se realiza por enriquecimiento de las secuencias blanco, ya sea mediante amplificación por PCR o mediante captura por hibridación¹³. El enriquecimiento por amplificación, la metodología más común para el uso forense de la NGS, es mejor cuando se trabaja con muestras limitadas o pequeños paneles génicos que presentan alta homología. En cambio, el enriquecimiento por captura, muy utilizado en diagnóstico clínico, es mejor para el análisis de paneles génicos amplios o, incluso, exomas completos.

Dada la importancia de los análisis genéticos, actualmente, tienen en el abordaje de la MS, ya que pueden proporcionar una explicación para porcentaje importante de los casos sin explicación después de una autopsia completa, permitiendo además la identificación de variaciones genéticas importante para la implementación de medidas preventivas en familiares. 

Este trabajo tiene como objetivo realizar una revisión bibliográfica tipo narrativa respecto de las plataformas NGS aplicadas a los estudios genéticos post mortem para determinar las causas subyacentes de las MS.

 

METODOLOGÍA

La metodología utilizada fue de carácter descriptivo/exploratorio. Las bases de datos consultada fue PubMed del Instituto Nacional de Salud (NIH). Las palabras clave en inglés y español para la búsqueda fueron: NGS, muerte súbita, autopsia molecular. Para NGS se encontraron más de 22000 publicaciones de las cuales aproximadamente 3000 son revisiones. Para muerte súbita, se encontraron más 65000 publicaciones, de los cuales más de 12000 son revisiones. En cambio, para NGS relacionada a muerte súbita 74 publicaciones que iniciaron en el 2014 hasta la fecha. De los cuales 5 son revisiones.

Además, se consultaron las bases de OMIN y ClinVar para los genes asociados. Se usaron los siguientes criterios de inclusión: artículos completos en español e inglés de libre acceso, con antigüedad máxima de diez años, realizados en cualquier área geográfica y que trataran sobre la temática. Dada la temática sobre afecciones cardiacas relacionadas a MS, NGS y autopsia molecular, se analizaron en total 67 artículos.

 

 

ETIOLOGÍA DE LA MUERTE SÚBITA

 

MUERTE SÚBITA CARDÍACA (MSC)

La Muerte Súbita Cardiaca (MSC) (Sudden Cardiac Death), es toda aquella MS que no puede ser atribuida a causas extracardíacas^14-15. Se estima que anualmente mueren unos 5 millones de personas en el mundo debido a MSC)¹⁵. Sin embargo, su incidencia está subestimada, ya que en muchos casos la identificación de algún indicio macro o microscópico en la autopsia es ambigua e independientemente de su relevancia funcional, es considerada suficiente para certificar la causa de muerte².

Aproximadamente, entre el 70%-85%^2-3, de los casos de MS en la población general, se deben a una causa cardíaca, mientras que en la población joven (menor a 35 años) ese porcentaje disminuye al 57%².

En la población joven, la MSC está causada principalmente por cardiopatía isquémica prematura, cardiomiopatías o canalopatías^5,14. En el caso de individuos mayores a 40 años, la principal causa de MSC es la arteriopatía coronaria¹⁶.

Aproximadamente, dos tercios de las autopsias de víctimas jóvenes de MSC presentan anomalías estructurales del corazón y la mitad de esos casos son de origen hereditario¹⁴. El tercio restante, donde la autopsia no detecta causas de muerte (30% de autopsias describen corazones estructuralmente normales¹⁷), se clasifican como Muerte Súbita Inexplicada (MSI), también conocida como síndrome de muerte súbita por arritmia (Sudden Arrythmia Death Syndrome, SADS por sus siglas en inglés)¹⁸, siendo las canalopatías su principal causa².

 

CARDIOMIOPATÍAS ESTRUCTURALES

Las cardiomiopatías estructurales son potencialmente la principal causa de MSC con una frecuencia reportada del 46%¹⁹, siendo principalmente la cardiomiopatía hipertrófica (CMH), la cardiomiopatía dilatada (CMD) y la cardiomiopatía arritmogénica de ventrículo derecho (CAVD), las más frecuentemente relacionadas a la MSC.

 

Cardiomiopatía Hipertrófica (CMH)

Está caracterizada por hipertrofia del ventrículo izquierdo en ausencia de otra enfermedad cardíaca o sistémica capaz de producir la magnitud observada de aumento del grosor de la pared ventricular^20-22. En la autopsia presenta hipertrofia, desorden de la miofibras e incremento de la fibrosis intersticial¹⁸.

Las causas genéticas son heterogéneas e incluyen más de 450 variantes patogénicas en más de 30 genes, principalmente genes codificantes de proteínas sarcoméricas (comúnmente involucradas) del metabolismo del calcio y mitocondriales^{18, 23, 24}. Entre el 30 y el 40% de las mutaciones descriptas se encuentran en 5 genes (ACTN2, CSRP3, TCAP, LDB3, VCL) asociados a los miofilamentos²³. Presenta, principalmente, herencia autosómica dominante¹⁸.

La CMH ocurre generalmente por una única mutación, aunque con penetración y expresión variable, debido en parte a otros factores genéticos y no genéticos. Aproximadamente un 5% de los individuos presentan dos o más variantes patogénicas (en uno o varios genes). Las variantes genéticas producen un gradiente de efectos fenotípicos, desde causales hasta clínicamente despreciables²⁵.

 

Cardiomiopatía Dilatada (CMD)

Se considera el tipo más común de cardiomiopatía, a menudo asociada con otras condiciones (por ejemplo, abuso de alcohol, exposición a toxinas, como el plomo, el mercurio y el cobalto; ciertas medicaciones oncológicas), comúnmente representa la principal causa de insuficiencia cardíaca^{19, 26}. Es una condición altamente compleja con amplia heterogeneidad fenotípica que se caracteriza por dilatación y alteración de la contracción de uno o ambos ventrículos, con la consecuente función sistólica alterada^{19, 27, 28}. Los pacientes afectados por lo general desarrollan insuficiencia cardíaca manifiesta y pueden presentar riesgo de arritmias (la CMD incluye formas tanto arritmogénicas como no arritmogénicas). Las manifestaciones pueden incluir arritmias auriculares y/o ventriculares y puede ocurrir la muerte por arritmias o insuficiencia cardíaca progresiva²⁸.

La CMD idiopática, frecuentemente tiene una etiología genética y se considera familiar cuando más de un pariente de primer grado ha sido diagnosticado con CMD o ha experimentado una MSC. Aproximadamente 20-40%^28-29 de las CMD idiopáticas son consideradas familiares, con la mayoría de los casos heredados en forma autosómica dominante. Puede surgir de mutaciones en aproximadamente 40 genes. Las pruebas genéticas actuales identifican variantes en alrededor del 40-50% de los casos, lo que sugiere que quedan por descubrir genes adicionales de cardiomiopatía. Las variantes patogénicas se encuentran en genes que codifican proteínas del citoesqueleto, sarcoméricas, desmosómicas, de membrana nuclear y de unión al ARN, lo que indica la complejidad y heterogeneidad genética de la CMD y que diferentes mecanismos subyacentes son capaces de generar el fenotipo de esta patología^{19, 28}.

 

Cardiomiopatía Arritmogénica de Ventrículo Derecho (CAVD)

Se caracteriza por un adelgazamiento de la pared del ventrículo derecho, atrofia e infiltración fibroadiposa del miocardio¹⁸. El reemplazo fibroadiposo de los miocitos produce un retraso en la conducción intraventricular e inestabilidades eléctricas²⁴. Es representativa de muertes súbitas en atletas y adultos jóvenes³⁰.

Las variantes asociadas con esta patología se encuentran principalmente localizadas en genes que codifican proteínas de adhesión celular (DES, DSC2, DSG2, DSP12, JUP, LDB3, PKP2, RPSA, RYR2, TGFB3, TMEM43 y TTN)¹⁸. En la gran mayoría de los casos presenta herencia autosómica dominante, con penetrancia incompleta en la mitad de ellos^{18, 23}, que afecta a los hombres con mayor frecuencia³¹.

 

CARDIOMIOPATÍAS NO ESTRUCTURALES: CANALOPATÍAS

Del tercio de las MS clasificadas inicialmente como MSI (donde la víctima presentó examen toxicológico y anatómico normal), la mayoría se encuentran asociadas a canalopatías cardíacas¹⁸. Los individuos que poseen una canalopatía suelen tener un corazón estructuralmente normal, pero estar predispuestos a presentar síncope/crisis arrítmicas y muerte súbita cardíaca³². Las canalopatías cardíacas están asociadas a variantes patogénicas en genes que codifican canales iónicos, receptores y/o proteínas reguladoras en los cardiomiocitos, modificando potenciales de acción y/o metabolismo del calcio, produciendo alteraciones del ritmo cardíaco, electrocardiograma (ECG) anormal y riesgo incrementado de MS. Las manifestaciones más comunes son disnea, palpitaciones, mareo, síncope y, una gran proporción de los pacientes puede llegar asintomáticos a la MSI¹⁸.

Los desórdenes de canales iónicos más comunes asociados a MSI son el síndrome de QT largo (SQTL), el síndrome de QT corto (SQTC), el síndrome de Brugada (SB) y la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) ^{5, 18, 33}.

 

Síndrome de QT largo (SQTL)

Se caracteriza por la prolongación del intervalo QT y anomalías de la onda T en el ECG. Se puede producir por factores genéticos como por factores adquiridos causado por variantes en los genes asociados a las proteínas de los canales iónicos transmembrana de sodio³⁴.

En el SQTL se han descripto más de 500 mutaciones en 13 genes, pero el 75% de las mismas ocurren solo en 5 genes (KCNQ1, KCNH2, KCNE1, KCNE2 y SCN5A) que codifican canales iónicos responsables del potencial de acción cardíaco²³. Un 5% de los casos descriptos se debe a 2 mutaciones y, alrededor de una cuarta parte no tiene un locus genético reconocido³⁵.

 

Síndrome de QT corto (SQTC)

Actualmente el SQTC está asociado a mutaciones en 5 genes diferentes que codifican canales de potasio (KCNH2, KCNQ1 y KCNJ2) y calcio (CACNA1C y CACNB2B)²³.

 

Síndrome de Brugada

Se caracteriza por anomalías del segmento ST en las derivaciones precordiales derechas (V1-V3) en el ECG³⁶. Aunque suele manifestarse en la edad adulta, esta patología permite explicar algunos casos de SIDS⁶. Han sido descriptos cientos de variantes genéticas en más de 25 genes, aunque aún se desconoce el genotipo de aproximadamente el 70% de los casos²³. Existen evidencias que indican que se trata de una enfermedad oligogénica³⁵.

 

Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica (TVPC)

Aproximadamente el 70% de los casos de TVPC presenta variantes patogénicas en 1 de 3 genes (RyR2, KCNJ2 y CASQ2) distintos, habiéndose descripto más de 60 variantes²³.

 

MUERTE SÚBITA NO CARDÍACA (MSNC)

La muerte súbita no cardíaca (MSNC) (Sudden Non-Cardiac Death), representa aproximadamente el 20% de las MS, y se debe a causas muy variables, como patologías pulmonares, neurológicas, cerebrovasculares, infecciones o síndrome aórtico ^3,37.

Las bases genéticas de las MSNC son menos claras³. Las patologías pulmonares pueden ser una combinación de factores genéticos y adquiridos. Entre ellas podemos encontrar el asma, el Síndrome de Hipoventilación Central Congénita (Congenital Central Hypoventilation Syndrome) e Hipertensión Arterial Pulmonar (Pulmonary Arterial Hypertension), esta última con origen hereditario en el 25-30% de los casos³⁷.

Las enfermedades neurológicas, como la epilepsia, también pueden originar MSNC. Los genes asociados a la MSI en epilepsia (Sudden Unexplained Death in Epilepsy) están relacionados principalmente a las vías de los canales dependientes de voltaje de sodio y potasio. En estos casos muchas veces se observan patrones genéticos poligénicos. Algunos de los genes involucrados también se encuentran relacionados a cardiomiopatías. Las malformaciones arteriovenosas son otra causa de MSNC³. Patologías metabólicas y endócrinas pueden causar también MSNC, como defectos en la oxidación de ácidos grasos, malformaciones mitocondriales o la vía de secreción de la insulina³.

 

METODOLOGÍAS DE SECUENCIACIÓN Y ESTUDIOS GENÉTICOS POST MORTEM

Inicialmente, los análisis genéticos post mortem se realizaron mediante la metodología de secuenciación Sanger, centrándose en el estudio de unos pocos genes asociados a las canalopatías^38-40. Sin embargo, debido a la heterogeneidad y complejidad genética de estas patologías, implicaba el análisis de un gran número de genes diferentes, lo que producía enormes costos y demoras utilizando la secuenciación Sanger. La metodología más satisfactoria para llevar a cabo estos estudios fue la aplicación de las plataformas de NGS⁴¹.

En 2014, se llevó a cabo por primera vez un análisis WES en 28 casos de MS juvenil, logrando identificar 3 variantes raras en los principales genes asociados al SQTL. Además, mediante el uso de paneles amplificaron otros genes asociados a cardiomiopatías y canalopatías que permitieron identificar 6 variantes raras⁴². Posteriormente, el mismo equipo de investigadores realizó un estudio retrospectivo de 51 casos de MS en niños y adultos jóvenes de 1 a 35 años en Australia y Nueva Zelanda, entre los años 2010 y 2012, donde estudiaron paneles de genes y hallaron una mutación genética cardíaca clínicamente relevante en 31 casos. Cabe resaltar que, además, realizaron un diagnóstico clínico en el 13% de las familias en las que ocurrió una MS producto de una enfermedad cardiovascular hereditaria⁴³. El cuadro 1 muestra los estudios genéticos más destacados realizados en MS.

 

DISCUSIÓN

Diferentes estudios han demostrado la aplicabilidad de distintas plataformas de NGS para el diagnóstico de enfermedades complejas y multifactoriales, como el análisis de genes relacionados a patologías cardíacas⁵³, permitiendo realizar los diagnósticos genéticos de forma más rápida y accesible⁵⁴.

Las metodologías NGS permiten realizar estudios, tanto para la investigación de nuevas variantes genéticas de interés, como para el análisis de paneles genéticos específicos.

La aplicación de las plataformas NGS permite detectar continuamente genes y nuevas variantes génicas relacionadas a las cardiopatías²⁹, lo que hace imprescindible la selección de los genes más informativos para la generación y/o actualización de los paneles de uso en el análisis de las MSC.

Para llevar adelante correctamente los estudios genéticos post mortem se debe asignar de la forma más certera posible un nivel de efecto patológico a una variante genética. La frecuencia de las mutaciones identificadas en cada una de las patologías y la asociación mutación-patología depende de la precisión en la determinación del fenotipo exacto de las mismas. Esto no siempre es fácil, ya que las patologías cardíacas hereditarias asociadas con la MSC muestran penetrancia incompleta y expresividad variable^{2, 18, 55}, resultado de combinaciones complejas de factores genéticos (conocidos y desconocidos), ambientales y de estilo de vida⁵⁵. Todas las patologías tratadas tienen como característica común una base genética sumamente heterogénea y compleja, que puede conducir a fenotipos superpuestos y/o a asociaciones genotipo-fenotipo débilmente establecidas^{29, 56, 57}, teniendo en cuenta que algunos de los genes son comunes a más de una de las patologías^29,49. Adicionalmente, existen genes modificadores, que favorecen esta complejidad fenotípica^{35, 55}. Para comprender la complejidad en relación a la cantidad de genes involucrados, en octubre del año 2016 la Base de Datos de Mutaciones Genéticas Humanas (HGMD, Human Gene Mutation Database, www.hgmd.cf.ac.uk) contaba con más de 12.000 variantes de secuencias en más de 150 genes relacionadas a patologías cardíacas¹⁶. En el cuadro 2 ( Anexo 1), se presenta información de interés de genes relacionados a la MS, preparada a partir de datos obtenidos de publicaciones seleccionadas^{3, 5, 23, 28, 33, 35, 58, 59}, complementados utilizando los registros correspondientes de la base de datos de enfermedades raras ORPHANET⁶⁰. Existen cada vez más evidencias que sugieren que las variantes genéticas inicialmente descriptas como relacionadas a una determinada patología se encuentran en realidad interrelacionadas con las demás⁵⁷. Todo esto hace que la cantidad de información genética para tener en cuenta en el estudio sea muy amplia y compleja.

Además, el médico puede solicitar una gran diversidad de estudios (imágenes, fisiológicos, farmacológicos, bioquímicos, etc.) al paciente vivo para poder realizar la determinación precisa del fenotipo. En estos casos, el screening genético de los pacientes se efectúa en base a la sospecha de una patología hereditaria según los análisis previos, la historia clínica del paciente y antecedentes familiares¹⁸. Sin embargo, en el ámbito forense no se dispone de muchos de estos parámetros que permitan determinar con precisión el fenotipo de la víctima y poder asociarlo a las mutaciones que se pudieran hallar en su análisis genético. Asimismo, se debe tener en cuenta que la cantidad de estudios publicados (y cantidad de casos en cada uno de ellos) respecto de la relación mutación-fenotipo de patologías relacionadas a la MSC es mucho mayor en el ámbito clínico que en el forense¹⁸.

En el ámbito forense no se toman y almacenan rutinariamente muestras para análisis de ADN en casos de MSC¹⁶, lo que dificulta el acceso a muestras para poder llevar a cabo estudios moleculares. Debido a todo ello, las precisiones en las relaciones genotipo-fenotipo son diferentes en la clínica y en el campo forense, siendo mucho menores en este último¹⁸.

La principal limitación de las autopsias moleculares es esta carencia de asociaciones genotipo-fenotipo precisas, que permiten establecer la patogenicidad genética⁸. Por tal motivo, es necesario impulsar y ampliar los estudios genéticos de las patologías asociadas a la MSC, aprovechando las ventajas de las plataformas de NGS, a fin de establecer con mayor precisión las relaciones fenotipo-genotipo y seleccionar los genes que resultan más informativos como marcadores moleculares. Estas plataformas, al permitir el análisis del genoma y/o exoma completo de un individuo, posibilitan analizar una gran cantidad de genes de forma no selectiva (no acotada a una patología específica) simultáneamente, pudiendo identificar fácilmente variantes de secuencia relacionadas a la MSC. Aunque el análisis por NGS de múltiples genes mejora la sensibilidad diagnóstica respecto a la secuenciación Sanger, la falta de una relación precisa de las variantes genéticas con los distintos fenotipos patológicos complica enormemente el análisis y la interpretación correcta de los datos, la cual es esencial para obtener resultados específicos y útiles^{49, 61.}

El análisis de los datos crudos que arrojan las plataformas NGS incluyen el procesamiento optimizado de la señal analítica, asignación de bases, alineamiento de secuencia, determinación de variantes genéticas⁴¹, la depuración y categorización de las mismas^{7, 44} en relación con su patogenicidad. Para facilitar la interpretación y minimizar los errores se requieren herramientas bioinformáticas que ayudan a discriminar errores metodológicos (por ejemplo, errores de secuenciación o de alineación, frecuencia alélica menor para variantes raras) que permiten determinar si realmente son variantes o “ruido de fondo”.

Por último, se debe establecer la importancia funcional en las variantes halladas. Para ello, deben ser comparadas con la información previa que se tiene (de existir) sobre la posible patogenicidad de estas. Existen bases de datos, como ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar), OMIM (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim), HGMD, Base de Datos Consenso (CDS, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi), Exome Aggregation Consortium (ExAC, http://exac.broadinstitute.org), Genome Aggregation Database (gnomAD - http://gnomad.broadinstitute.org), entre otras,  que recogen información funcional y/o patológica sobre variantes previamente evaluadas a nivel mundial. La importancia de estas bases de datos radica en que se encuentran en constante cambio y actualización a medida que se acrecienta el conocimiento de variantes, por lo tanto, se reclasifican y esto facilita poder obtener un mejor diagnóstico. El crecimiento de las bases de datos públicas con datos de las variantes genéticas es fundamental para el avance de las metodologías de análisis genéticos post mortem.

Existen diversas herramientas in silico  como PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), Mutation Taster (https://www.mutationtaster.org/),  FATHMM (http://fathmm.biocompute.org.uk/),  Mutation Assessor (http://mutationassessor.org/r3/), Human Splicing Finder (http://umd.be/Redirect.html),  entre otras,  que permiten predecir el efecto de una mutación genética en la proteína. El ACMG recomienda el uso de una terminología estándar para clasificar las variantes: "patogénica", "probablemente patogénica", "probablemente benigna", "benigna" y "variante de significado incierto" (VUS, Variants of uncertain significance)^62-63.

Un factor muy importante para tener en cuenta son las VUS, ya que no existe aún suficiente evidencia que asocie dicha variante de secuencia a un rol fenotípico². Estas variantes son halladas comúnmente en las autopsias moleculares y, actualmente, no existen lineamientos en el campo forense respecto del manejo e interpretación de las mismas^{2, 4}. Aunque el ACMG y la Association for Molecular Pathology (AMP) han publicado una guía para la interpretación de variantes de secuencia en el ámbito clínico, la cual no está validada para su uso forense⁶⁴. Sin embargo, recientemente el ACMG ha recomendado seguir dicha guía en los análisis genéticos post mortem⁹. Debido a la alta complejidad de estos estudios genéticos, es recomendable la interpretación de los resultados por parte de un equipo interdisciplinario de expertos^{2, 8, 16,  64}, teniendo en mente que estos análisis genéticos son estudios probabilísticos y no determinísticos⁶⁴. Para ejemplificar la complejidad de estos estudios, utilizaremos el estudio realizado recientemente por Ariza y colaboradores⁶⁵ del exoma de un individuo víctima de MS. En él analizaron simultáneamente 4834 genes clínicamente relevantes para estos cuadros. Se determinaron inicialmente 8851 variantes de secuencia, las cuales fueron filtradas mediante los criterios de la guía de la ACMG y AMP y, posteriormente, comparadas con las secuencias contenidas en diferentes bases de datos. Concluyeron que el individuo presentaba 5 variantes de relevancia clínica para el diagnóstico de MS.

El rendimiento diagnóstico por WES se estima que varía entre 15 y 50%. El reanálisis de las secuencias obtenidas, utilizando herramientas bioinformáticas actualizadas, bases de datos ampliadas, protocolos de análisis e interpretación mejorados y aplicando conocimientos genómicos actualizados de las patologías permite aumentar dicho diagnóstico. La reevaluación en estas condiciones de datos WES obtenidos entre 1 y 7 años previos permitió una mejora del 10% en el rendimiento diagnóstico de casos de MS y enfermedades idiopáticas⁶⁶.

En contraste, la aplicación de la autopsia molecular de forma rutinaria en la investigación forense debe basarse en recomendaciones incluyendo muestra a utilizar, pruebas genéticas a realizar y genes a investigar, en relación con los hallazgos micro y macroscópicos de la autopsia, análisis y seguimiento de los familiares, etc. Esto permitiría centrar los esfuerzos en los genes más informativos, para lo cual, como se dijo anteriormente, los estudios de asociación genotipo-fenotipo son fundamentales.

Al analizar la rentabilidad diagnóstica de la implementación de las metodologías de NGS en casos de MSC⁶⁷, se determinó que el análisis genético dirigido por fenotipo mediante NGS permitió detectar mutaciones diagnósticas en 5 de 9 casos que previamente habían arrojado resultado negativo mediante secuenciación Sanger. Sin embargo, se pueden aplicar de forma complementaria, utilizando secuenciación Sanger para corroborar las secuencias obtenidas por NGS con baja cobertura, cobertura incompleta, regiones de baja exactitud de secuencia o validar variantes patogénicas o poco comunes halladas (frecuencia menor al 1% en la población)^{2,7,29,41,44,46}.

Como una gran proporción de MSC se debe a factores hereditarios, el análisis genético de una víctima no solo debe depender de las observaciones de la autopsia, sino que la información obtenida del análisis de la familia podría ayudar a establecer la causa de muerte. De esta forma, la autopsia molecular como parte de la investigación forense tiene el potencial de mejorar la tasa de diagnóstico de casos de MSC y, al mismo tiempo, brindar información a la familia sobreviviente de la víctima que le podría ser de suma utilidad clínica¹⁸. En casos de MSC de etiología estructural que pudiera ser potencialmente de origen genético se recomienda el análisis genético dirigido en base a las asociaciones genotipo-fenotipo conocidas para dichas patologías, mientras que en caso de MSI se recomienda analizar mutaciones conocidas relacionadas a la generación de arritmias¹⁵.

 

CONCLUSIONES

Los orígenes de las patologías que dan lugar a los casos de MS son múltiples, complejos y pueden generar fenotipos variables y superpuestos que dificultan los análisis genéticos de las mismas y, especialmente, la interpretación de los resultados obtenidos. Las plataformas de NGS son sumamente útiles en la investigación de los casos de muerte súbita, permitiendo el análisis de una gran cantidad de genes simultáneamente, de forma rápida y a bajo costo. Sin embargo, su aplicación de forma rutinaria está supeditada a:

1.    Disponibilidad de infraestructura, equipamiento e insumos.

2.    Incremento en los estudios de asociación genotipo-fenotipo, especialmente en muestras forenses.

3.    Formación de equipos multidisciplinarios para la interpretación correcta de las variantes de secuencia obtenidas.

4.    Establecimientos de guías de toma, acondicionamiento y procesamiento de muestras para autopsia molecular, como así también de criterios de interpretación de resultados.

5.    Capacidad para analizar y realizar el asesoramiento genético de los familiares en primer grado de las víctimas.

Asimismo, debe tenerse en cuenta que la utilización de las NGS y la secuenciación Sanger no son mutuamente excluyentes sino, por el contrario, complementarias, ya que se debe utilizar esta última para corroborar ciertos resultados específicos de las primeras.

 

 

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60.         Rath A, Olry A, Dhombres F, Brandt MM, Urbero B, Ayme S. Representation of rare diseases in health information systems: the Orphanet approach to serve a wide range of end users. Human mutation [Internet]. 2012. [citado 14 junio 2023]; 33(5), 803-808. doi.org/10.1002/humu.22078. Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/humu.22078

61.         Boschi B, Giotti I, Pelo E, Ricci U. Study by next generation sequencing of sudden cardiac death (SCD). Forensic Science International: Genetics Supplement Series [Internet]. 2019. [citado 14 junio 2023]; 7(1), 158-160. doi.org/10.1016/j.fsigss.2019.09.062. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1875176819301180

62.         Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in medicine. [Internet] 2015. [citado 14 junio 2023]; Vol. 17, no 5, p. 405-423. doi:10.1038/gim.2015.30. Disponible en: https://www.nature.com/articles/gim201530

63.         Riggs ER, Andersen EF, Cherry AM, Kantarci S, Kearney H, Patel A, et al. Technical standards for the interpretation and reporting of constitutional copy-number variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) and the Clinical Genome Resource (ClinGen). Genetics in Medicine. [Internet]. 2020. vol. 22, no 2, p. 245-257. doi.org/10.1038/s41436-019-0686-8. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1098360021013009

64.         Scheiper-Welling S, Tabunscik M, Gross TE, Jenewein T, Beckmann BM, Niess C, et al. Variant interpretation in molecular autopsy: a useful dilemma. International Journal of Legal Medicine [Internet]. 2022. [citado 14 junio 2023]; 136(2), 475-482. doi.org/10.1007/s00414-021-02764-z. Disponible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s00414-021-02764-z

65.         Ariza JA, Rocha AHM, Pérez RC, Bermudez-Santana CI. Next-generation sequencing of postmortem molecular markers to support for medicolegal autopsy. Forensic Science International: Reports [Internet]. 2022. [citado 14 junio 2023]; 6, 100300. doi.org/10.1016/j.fsir.2022.100300. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2665910722000469

66.         Salfati EL, Spencer EG, Topol SE, Muse ED, Rueda M, Lucas JR, et al. Re-analysis of whole-exome sequencing data uncovers novel diagnostic variants and improves molecular diagnostic yields for sudden death and idiopathic diseases. Genome medicine [Internet]. 2019. [citado 14 junio 2023]; 11(1), 1-8. doi.org/10.1186/s13073-019-0702-2. Disponible en: https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-019-0702-2

67.         Jiménez-Jáimez J, Martínez VA, Fernández MJ, Jiménez FB, Perin F, Ramírez JMO, et al. Diagnóstico clínico y genético de la muerte súbita cardiaca de origen no isquémico. Revista Española de Cardiología [Internet]. 2017. [citado 14 junio 2023]; 70(10), 808-816. doi.org/10.1016/j.recesp.2017.01.010. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0300893217300817

 

 

Cuadro 1. Estudios representativos de MS aplicando NGS.
Año	Autores	No. de casos	Genes estudiados	Tipo de casos	Hallazgos	Tipo de asociaciones	Observaciones
2015	Buscemi y col44	3	68 genes presentes en el Ion AmpliSeq Inherited Disease Panel (IDP)  asociados a canalopatías hereditarias	MSI en menores de 35 años	Variante sin sentido en el gen KCNH2 (L955V)	Variante asociada a SQTL
					Variante sin sentido en el gen MYH7 (K1587X)	Variante asociada a MSC
					Variante en el gen ABCC9 (V1137I)	Síndrome de repolarización precoz
2015	Farrugia y col45	16	23 genes asociados a canalopatías	MSI en menores de 35 años	Variantes “probablemente patogénicas” en el gen KCNH2 c.3457C > T (p.His1153Tyr)	SQTL	Hallaron dos variantes "probablemente patógena" en los genes ANK2 ( c.5509G > A) y SCN5A (c.6007G > A) en un caso de una persona que falleció durante una hospitalización psiquiátrica tras la administración de un fármaco que prolonga el intervalo QT
					Variantes “probablemente patogénicas” en el gen, ANK2 c.5509G >A (p.Glu1837Lys)	SQTL
					Variantes “probablemente patogénicas” en el gen SCN5A c.6007G >A (p.Asp2003Asn)	SQTL / SB
					Variantes “probablemente patogénicas” en el gen RyR2 c.4742A >C (p.Gln1581Pro)	TVPC
2016	Anderson y col46	32	Los genes KCNQ1, KCNH2, SCN5A y RyR2 asociados a canalopatías y 100 genes asociados a MSC	MSI en menores de 19 años relacionados con el esfuerzo	3 variantes “patogénicas” en los genes: CALM2-F90L, CALM2-N98S y PKP2-N634fs	SQTL / TVPC	En los genes KCNQ1, KCNH2, SCN5A y RyR2 hallaron una posible mutación patogénica en 11 casos. Posteriormente, elevaron a 100 genes para estudiaron los restantes 21 casos de MSI
					11 variantes consideradas VUS	-
2016	Hata y col47	25	70 genes asociados a cardiomiopatías y canalopatías	MSI en rango etario 19-50 años	Variantes patogénicas KCNQ1_G626_P631del, y KCNH2_M579fs+75X	SQTL	Encontraron variantes raras heterocigotas combinadas en 3 de los 25 casos y 2 sujetos eran portadores de 3 o más variantes
					Variantes patogénicas MYH7_A26V y MYBPC3_ T1046M	CMH / CMD
					Variante patogénica DSG2_R824C	CAVD
					Variantes probablemente patogénicas en los genes RYR2, CACNA1C y ANK2	Canalopatías
					Variantes probablemente patogénicas en los genes MYH7, LDB3 y PRKAG2	CMH / CMD
					Variantes probablemente patogénicas en los genes PKP2, JUP, DSG2, DSP y TMEM43	CAVD
2017	Hellenthal y col16	10	174 genes asociados a cardiomiopatías y canalopatías	MSC rango etario 19-40 años	Variantes patogénicas en los genes KCNH2 y CACNA1C	SQTL
					Variante patogénica en el gen TNNT2	------
2018	Neubauer y col48	34	192 genes asociados a enfermedades cardiovasculares y enfermedades metabólicas	MSI en menores de 40 años	Variantes probablemente patogénicas en los genes RYR2, ACAD9, AKAP9, KCNE5, SEMA3A	Canalopatías
2018	Campuzano y col49	44	108 genes asociados a MSC	MSC en menores de 1 año	121 variantes consideradas VUS	--------
2021	Ripoll-Vera y col50	62	194 a 380 genes asociados a cardiopatías	MS menores de 50 años	Variantes patogénicas en los genes MYH7 y MYBPC3	MCH	Realizaron además un estudio familiar que permitió detectar a 21 de portadores de cardiopatías, de los cuales 5 estaban en riesgo, por lo que se indicó implante de desfibrilador.
					Variante patogénica en el gen PPA2	MCD
					Variante probablemente patogénica en el gen LMNA	MCD
					Variante probablemente patogénica en el gen TTN	MHC
					Variante probablemente patogénica en los genes RyR2, KCNH2 y SCN5A	SQTL
2022	Fadoni y col51	16	40 genes asociados a MCH	MSC en personas de 16 a 50 años	Variantes patogénicas en los genes MYBPC3 and MYH7	MCH
2022	Girolami y col52	22	174 genes asociados a cardiomiopatías y canalopatías	MSC en menores de 50 años	Variantes patogénicas en los genes MYBPC3, TNNT2 y TCAP	MCH
					VUS en los genes TTN, TNNT2, MYH6, DSP, ACTN2, CALR3, and MYH7	MCH / MCD
					Variante patogénica en el gen SCN5A	SB
SQTL: Síndrome de QT Largo, MSI: Muerte Súbita Inexplicada; MSC: Muerte Súbita Cardiaca; SB: Síndrome de Brugada; TVPC: Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica; CMH: Cardiomiopatía Hipertrofica;  CMD: Cardiomiopatía Dilatada; CAVD: Cardiomiopatía Arritmogénica de Ventrículo Derecho; VUS: variante de significado incierto

 

 

 

 

 

 

Cuadro 2 – Genes de interés en la investigación de MS

Gen	Locus	OMIM ID	Proteína	MS	Fenotipo	Herencia	Referencia. sobre MS
?	14q23–q24 (locusmD14S42)		?	Cardíaca	CAVD		Ref. 5
?	10p12-p14		?	Cardíaca	CAVD		Ref. 5
?	7p22-p14		?	Cardíaca	TVPC		Ref. 5
ABCC8	11p15.1	600509	ATP Binding Cassette, Subfamilia C, Miembro 8 / SUR 1	No Cardíaca	Hipoglucemia hiperinsulinemica		Ref. 3
ABCC9	12p12	601439	ATP Binding Cassette, Subfamilia C, Miembro 9 / SUR 2	Cardíaca	SB	AD	Ref. 21, 33, 59
					CMD		Ref. 28, 59
ABLIM1	10q25.3	602330	Limatin (proteína LIM de unión a actina)	Cardíaca	CMD	AD	Ref. 59
ACTC1	15q14	102540	α-actina cardíaca	Cardíaca	CMD	AD	Ref. 28, 59
					CMH, CR		Ref. 3
					CMH		Ref. 59
					CAVD